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致泻大肠埃希氏菌标准检验方法(三)

(八)尿素琼脂

蛋白胨1g,致泻氯化钠5g,大肠葡萄糖1g,埃希磷酸二氢钾2g,氏菌0.4%酚红溶液3mL,标准琼脂20g,检验蒸馏水1000mL,致泻20%尿素溶液100mL,大肠pH7.2±0.1。埃希

将除尿素和琼脂以外的氏菌成分配好,并校正pH,标准加入琼脂,检验加热溶化并分装烧瓶。致泻121℃高压灭菌15min。大肠冷却至50~550C,埃希加入经除菌过滤的尿素溶液。尿素的最终浓度为2%,最终pH为7.2±0.1。分装于灭菌试管内,放成斜面备用。

试验方法:挑取琼脂培养物接种,在36-1℃培养24h,观察结果。

尿素酶阳性者由于产碱而使培养基变为红色。

(九)缓冲葡萄糖蛋白胨水(V—P试验用)

V-P试剂

磷酸氢二钾5g,多胨7g,葡萄糖5g,蒸馏水1000mL,pH7.0。

溶化后校正pH,分装试管,每管1 mL,1210C高压灭菌15min。

V—P试验方法:用琼脂培养物接种本培养基中,于36±1℃培养2~4d。加入6%a-萘酚-酒精溶液0.5mL和40%氢氧化钾溶液O.2mL,充分振摇试管,观察结果。阳性反应立刻或于数分钟内出现红色,如为阴性,应放在36±l℃下培养4h再进行观察。

(十)氰化钾(KCN)培养基

蛋白胨10g,氯化钠5g,磷酸二氢钾0.225g,磷酸氢二钠5.64g,蒸馏水1000mL,O.5%氰化钾溶液20mL,pH7.6。

将除氰化钾以外的成分配好后分装烧瓶,1210C高压灭菌15min。放在冰箱内使其充分冷却。每100mL培养基加入0.5%氰化钾溶液2.OmL(最后浓度为l:10000),分装于12mm×100mm灭菌试管,每管约4mL,立刻用灭菌橡皮塞塞紧,放在40C冰箱内,至少可保存2个月。同时,将不加氰化钾的培养基作为对照培养基,分装试管备用。

试验方法:将琼脂培养物接种于蛋白胨水内成为稀释菌液,挑取一环接种于氰化钾(KCN)培养基。并另挑取一环接种于对照培养基。36±10C培养1~2d,观察结果。如有细菌生长即为阳性(不抑制),经2d细菌不生长为阴性(抑制)。

氰化钾是剧毒药物,使用时应小心,切勿沾染,以免中毒。夏天分装培养基应在冰箱内进行。试验失败的主要原因是封口不严,氰化钾逐渐分解,产生氢氰酸气体逸出,以致药物浓度降低,细菌生长,因而造成假阳性反应。试验时对每一环节都要特别注意。

(十一)蛋白胨水(靛基质试验用)

蛋白胨(或胰蛋白胨)20g,氯化钠0g,蒸馏水1000mL,pH7.4。

按上述成分配制,分装小试管,1210C高压灭菌15min(蛋白胨中应含有丰富的色氨酸。购买每批蛋白胨后,应先用已知菌种鉴定后方可使用。)

(十二)靛基质试剂

柯凡克试剂:将5g对二甲氨基苯甲醛溶解于75mL戊醇中。然后缓慢加入浓盐酸25mL。

欧一波试剂:将1g对二甲氨基苯甲醛溶解于95mL 95%酒精内。然后缓慢加入浓盐酸20mL。

试验方法:挑取小量培养物接种,在36±10C~培养1~2d,必要时可培养4~5d。加入柯凡克试剂约O.5mL,轻摇试管,阳性者于试剂层呈深红色;或加入欧一波试剂约O.5mL,沿管壁流下,覆盖于培养液表面,阳性者与液面接触处呈玫瑰红色。

(十三)半固体琼脂

蛋白胨lg,牛肉膏0.3g,氯化钠O.5g,琼脂0.35~O.4g,蒸馏水100mL,pH7.4。

按以上成分配好,煮沸使溶解,并校正pH。分装小试管。1210C葛压灭菌:15min,直立凝固备用。

(十四)Elek氏培养基(毒素测定用)

豚胨20g,麦芽糖3g,乳糖O.7g,氯化钠5g,琼脂15g,40%氢氧化钠溶液1.5mL,蒸馏水1000mL,pH7.8。

用500mL蒸馏水溶解除琼脂以外的成分,煮沸,并用滤纸过滤。

用1mol/L氢氧化钠校正pH。用另外500mL蒸馏水加热溶解琼脂。

将两液混合,分装试管:10mL或20mL。1210C高压灭菌:15min。临用时加热溶化琼脂倾注平板。

(十五)氧化酶试剂

1%盐酸二甲基对苯二胺溶液:少量新鲜配制,于冰箱内避光保存。

1%a-萘酚溶液。

取洁净白滤纸沾取菌落。加盐酸二甲基对苯二胺溶液一滴,阳性者呈粉红色,并逐渐加深,再加一滴a-萘酚溶液,阳性者于30s内呈现鲜蓝色。阴性于2min内不变色。

(十六)乳糖胆盐发酵培养基

成分:蛋白胨20g,猪胆盐(或牛、羊胆盐)5g乳糖10g,0.04%溴甲酚紫水溶液25mL,蒸馏水1000mL,pH7.4。

(十七)三糖铁琼脂(TSI)制备方法培养基。

成分:蛋白胨20g,牛肉膏5g,乳糖10g,蔗糖10g,葡萄糖1g,氯化钠5g,硫酸亚铁铵[Fe(NH4)2(SO4)]20.2g ,硫代硫酸钠0.2g,琼脂12g,酚红0.025g,蒸馏水1000mL,pH7.4。

制法:将除琼脂和酚红以外的各成分溶解于蒸馏水中,校正pH,加入琼脂煮沸溶化,加入0.2%酚红水溶液12.5mL,摇匀,分装试管,121℃高压灭菌15min,放置高层斜面备用。

(十八)赖氨酸脱羧酶试验培养基制备方法培养基。

成分:蛋白胨5g,酵母浸膏3g,葡萄糖1g,蒸馏水1000mL,1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL,L-氨基酸或DL氨基酸0.5或1g/100mL。

制法:除氨基酸以外的成分加热溶解后,分装每瓶100mL,分别加入各种氨基酸:赖氨酸、精氨酸和鸟氨酸。L-氨基酸按0.5%加入,DL-氨基酸按1%加入,校正pH至6.8,对照培养基不加氨基酸,分装于灭菌的小试管内,每管0.5mL,上面加一层液体石蜡,115℃高压灭菌10min。

试验方法:接种培养物于36±1℃培养18-24h,观察结果,氨基酸脱羧酶阳性者,由于产碱培养基应呈紫色,阴性者无碱性产物,但因葡萄糖产酸而使培养基变为黄色,对照管应为黄色。

(十九)Honda氏产毒肉汤

水解酪蛋白20g,酵母浸膏粉10g,氯化钠2.5g,磷酸氢二钠15g,葡萄糖5g,微量元素O.5mL,蒸馏水1000mL,pH7.5。

制法:溶解后校正pH,高压灭菌1210Cl5min,待冷45-500C时加入林可霉素溶液,每毫升培养基内含90μg。

微量元素配方:

硫酸镁5g,三氯化铁 O.5g,氯化钻2g,蒸馏水100mL。

(二十)致病性大肠埃希氏菌诊断血清、侵袭性大肠埃希氏菌诊断血清、产肠毒素大肠埃希氏诊断血清、出血性大肠埃希氏菌诊断血清。

(二十一)产肠毒素大肠埃希菌LT和ST酶标诊断试剂盒,上海市卫生防疫站出品。

(二十二)抗LT抗毒素。

(二十三)多粘菌素B纸片:300IU,φ16mm。

(二十四)革兰氏染色液。

参考资料:食品卫生微生物检验标准手册

相关链接:尿素琼脂磷酸氢二钾蛋白胨水

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